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HILIC是一种色谱疏散手艺-亲水作用色谱（hydrophilic-interaction chromatography）的简称，也称为非水反相色谱或者反反相色谱，由Alpert教授于1990年提出，并将HILIC模式和正相模式（NPLC）举行了区分[1] 。
HILIC模式和正相有着类似的洗脱方法，由于使用了反相溶剂系统（水和有机相），从而具备正相所没有的优势，例如系统中可以含水，关于化合物的稀释剂选择更多，重现性更好，可以毗连MS举行联用等等（HILIC模式含有高比例有机相，相比于水相更多的反相，更容易去溶剂化，增添离子化效率，提高迅速度，如图1所示） 。HILIC模式可以阻止使用离子对试剂，关于大极性化合物的制备很有益 。HILIC模式普遍应用于大极性化合物的疏散，例如药物、糖类、卵白、多肽、氨基酸等等 。
图1：差别模式对化合物的应用规模
HILIC的保存机制是液液分派、吸附作用、离子相互作用和亲水性保存作用等多种模式作用的综合体现，化合物的保存一样平常受其化学性子和结构、牢靠相和流动相作用以及流动相种类（有机溶剂种类以及流动相pH）影响 。
HILIC模式的色谱柱的牢靠相接纳未衍生化硅胶或杂化颗粒、酰胺基、氨基、二醇、两性离子、环糊精类、聚琥珀酰亚胺键合物质等极性填料，以是化合物的保存强度和其极性成正比，和流动相极性成反比 。极性溶剂的保存可以使牢靠相外貌形成一层极性层，如图2所示，因此关于使用液液分派作用举行保存的化合物，流动相中极性溶剂是必不可少的，一样平常至少包括3%极性溶剂 [2] 。
图2：胞嘧啶在流动相和牢靠相外貌吸附水层液液分派
在流动相中添加缓冲盐和添加剂也是常用手段，有助于改善峰型和保存，缓冲盐在面临牢靠相外貌极性层和非极性溶剂时，越发倾向于消融于极性层，随着盐浓度增添从而增添其亲水性， [3] 。
其中，甲酸铵和乙酸铵是最常用的缓冲盐，这得益于它们在有机溶剂中优异的消融性以及MS兼容性 。需注重的是，随着盐浓度的提高，化合物和牢靠相的离子作用会受到抑制，主要作用为液液分派 [4~7]，这就导致碱性化合物的保存削弱，是由于大宗的阴离子和碱性化合物配对形成中性离子对更容易溶于有机相；相反，酸性化合物保存则会增添，是由于带负电的硅醇离子倾轧作用削弱，从而与牢靠相作用增强 。
一些牢靠相填料外貌上具有带电硅醇，具有一定酸性，在pH5~9时，硅醇基团就处于电离状态，关于带电状态的化合物离子交流作用将饰演主要角色 [3] 。需注重的是，由于HILIC模式下具有高比例有机相，高或低pH的缓冲盐溶于其中时，其真实pH值会由缓冲盐pH值向中性靠近1~1. [8]，使化合物处于电离状态的pH值，更利于化合物的保存 。
一样平常酸性化合物在高pH（常用氨水、碳酸氢铵等）条件下保存强于低pH条件，碱性化合物在低pH（常用乙酸、甲酸、乙酸铵、甲酸铵等）条件下保存较好 。
HILIC模式洗脱溶剂强度为：四氢呋喃 < 丙酮 < 乙腈 < 异丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水（由弱至强），如图3所示，四氢呋喃、丙酮和乙腈洗脱能力最弱，可作为主要溶剂使用，由于丙酮的阻止波长330nm过高，在UV检测器使用受限（可用于CAD、ELSD、MS等），而乙腈是非质子溶剂，能够增添化合物和牢靠相外貌极性层的氢键作用，从而增添保存，因此作为最常用流动相之一，相当于反相中的水相，水的洗脱能力最强，常作为洗脱溶剂使用，可凭证化合物保存情形选择合适的洗脱溶剂 。
图3：HILIC模式洗脱溶剂强弱顺序
一样平常建议选择流动相起始比例消融样品 。由于HILIC模式乙腈的比例较高，许多大极性化合物难以消融，为了包管化合物消融，通�；峤蠹匀芗痢缢⒓状嫉扔τ糜谙∈图� 。在这种情形下和通例反相疏散类似，HILIC模式使用强洗脱稀释剂时也会导致溶剂效应问题 。而二甲基亚砜（DMSO）作为稀释剂，具有一定保存，并且DMSO在低波长下有较强的吸收，可能会影响目的化合物出峰，一样平常配合乙腈、甲醇使用，DMSO比例一样平常不凌驾25% 。
通例可以思量使用75%的乙腈和25%的甲醇混淆液作为稀释剂，也可以加一些添加剂助溶，如甲酸等 。需注重的是，样品的含水量若是过大，也会影响化合物出峰情形 。
由于大极性化合物的保存极易受大极性洗脱试剂的影响，有时洗针液中的残留洗濯溶剂会对化合物出峰爆发影响，或者要领难以重现，一样平常建议接纳流动相起始比例洗针 。
为包管在剖析历程中离子强度的稳固，可以在水相和有机相均加入同样浓度的添加剂，也可以思量预混，需注重的是，在流动相配制历程中，混淆后常�；岜⑽露茸�，使用前需安排至室温 。
色谱柱使用一段时间后，样品可能会残留在柱头梗塞柱筛板，这时可以思量接纳高浓度缓冲盐低流速举行反冲 。以默克色谱柱SeQuant? ZIC-HILIC为例，首先接纳30倍柱体积的超纯水举行冲洗，再用30倍柱体积的缓冲盐（可以用500mM乙酸铵溶液）举行冲洗，最后再用30倍柱体积的超纯水举行冲洗，差别填料处置惩罚可能差别 。
关于未知化合物要领开发，可接纳如图4所示的一样平常思绪举行 。需注重的是由于HILIC模式化合物保存方法特殊，牢靠相的极性水层泉源于流动相，梯度不可转变过快，柱平衡需要留一准时间 。
图4：HILIC模式未知化合物要领开发一样平常思绪
关于已知化合物，则可以凭证化合物性子举行选择，首先判断酸碱性，可以用ACD举行模拟，从而举行色谱柱的选择 。
表1 色谱柱填料及应用规模
氨丁三醇在通例反相系统下没有保存，并且没有紫外吸收，遂接纳HILIC模式，选择CAD检测器举行要领开发 。氨丁三醇峰型优异，对称因子1.2（如图5所示），线性相关系数r 可做到1.000，接纳率在97%~104%之间 。
图5：氨丁三醇典范图谱
氨基酸大多是小分子两性化合物，在通例反相疏散模式下保存很弱，通常接纳衍生法举行检测，好比诵缘氨酸，其 pKa 和 logD 见下图：
图6：赖氨酸 pKa
图7：赖氨酸 logD
赖氨酸的 logD 在所有条件下都是负值，通例反相系统无法爆发保存行为，我们接纳HILIC模式解决了赖氨酸的剖析检测，获得了优异的保存（8min）和峰型（拖尾因子1.6），大大降低剖析本钱，便于要领转移和检测（如图8所示） 。
图8：赖氨酸典范图谱
关于没有保存、没有紫外吸收、不可碰水、极性和主因素靠近的杂质，该怎样剖析呢？尊龙凯时给出的谜底是HILIC-MS模式 。如葡甲胺的发补杂质中有一个席夫碱，该化合物极性大、没有紫外吸收、见水易剖析，该杂质和葡甲胺极性靠近，通例要领难以疏散 。
接纳HILIC-MS模式举行要领开发，最终葡甲胺和该席夫碱杂质疏散度在2.8以上，线性相关系数r为1.000，200ppm的LOD信噪比最小为25，接纳率在94%~103%之间，且要领耐用性优异，各参数细小转变下，均可抵达1.5以上基线疏散，接纳率在98%~102%之间 。
图9：疏散度溶液典范图谱
尊龙凯时已建设完善的剖析测试中心，可以接纳富厚的装备和多种先进的手艺（高区分、LCMSMS、GCMSMS、CAD、NMR、离子色谱、双三元等等）知足客户的各项剖析需求！
（撰稿：李墨；编审：杜建，毕增）
参考资料：
[1] Alpert, A. J., J. Chromatogr. 1990, 499, 177-196.
[2] Waters亲水作用色谱, Eric S. Grumbach 和 Kenneth J. Fountain
[3] Jandera, P., J. Sep. Sci. 2008, 31, 1421–1437.
[4] Strege, M. A., Anal. Chem. 1998, 70, 2439-2445.
[5] McCalley, D. V., J. Chromatogr. A 2007, 1171, 46-55.
[6] Naidong, W., J. Chromatogr. B 2003, 796, 209-224.
[7] Liu, M., Ostovic, J., Chen, E. X., Cauchon, N., J. Chromatogr. A 2009, 1216, 2362-2370.
[8] Fountain, K. J., Xu, J., Diehl, D. M., Morrison, D., J. Sep. Sci. 2010, 33, 740-751.
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