elisa实验效劳(酶联免疫吸附试验)

2016-05-31

会见量：

一、ELISA的基来源理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原及抗体的酶标记。连系在固相载体外貌的抗原或抗体仍坚持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保存其免疫学活性，又保存酶的活性。在测准时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体外貌的抗原或者抗体起反应。用洗涤的要领使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其它物质脱离。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而连系在固相载体上。此时固相载体上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产品，产品的量与受检物质的量直接相关，因此可以凭证呈色的深浅举行定性或定量剖析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的效果，使测定要领抵达很高的敏感度。

ELISA的基来源理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体外貌，可能是卵白和聚苯乙烯外貌间的疏水性部分相互吸附，并坚持其免疫学活性；

（2）抗原或抗体可通过共价键与酶毗连形成酶连系物，而此种酶连系物仍能坚持其免疫学和酶学活性；

（3）酶连系物与响应抗原或抗体连系后，可凭证加入底物的颜色反应来判断是否有免疫反应的保存，并且颜色反应的深浅是与标本中响应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的水平显示试验效果。

elisa

二、抗原和抗体

1.抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质�？乖牖搴�，可刺激机体爆发抗体和引起细胞免疫。
2.抗体是能与抗原特异性连系的免疫球卵白(Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。

三、ELISA的种类

1.直接法
直接法只能用来测定抗原：
①. 将抗原与固相载体毗连，洗涤除去未连系的抗原及杂质。
②.加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体连系。彻底洗涤未连系的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
③.加底物反应。固相上的酶催化底物成为有色产品，此时底物的降解量＝抗原量。

2.双抗夹心法
双抗夹心法，此法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于测半抗原抗体及小分子单价抗原抗体，此法既可以测抗体又可以测抗原：
测抗原的原理：
①.将特异性抗体与固相载体毗连，形成固相抗体。洗涤除去未连系的抗体及杂质。
②.加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体连系，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其它未连系物质。
③.加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体连系。彻底洗涤未连系的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
④.加底物反应。固相上的酶催化底物成为有色产品。通过比色，测知标本中抗原的量。
双抗夹心法测抗体的反应模式与测抗原类似，用特异性抗原举行包被和制备酶连系物，以检测响应的抗体。

3.间接法
原理：使用酶标记的抗抗体（抗人免疫球卵白抗体）以检测与固相抗原连系的受检抗体。
操作办法：
①.将特异性抗原与固相载体连结，形成固相抗原。洗涤除去未连系的抗原及杂质。
②.加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原连系，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其它成份在洗涤历程中被洗去。
③.加酶标抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体连系，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
④.加底物显色。

4.竞争法
原理：标本中的抗体（抗原）和一定量的酶标抗体（抗原）竞争与固相抗原（抗体）连系。标本中抗体（抗原）量越多，连系在固相上的酶标抗体（抗原）愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。

四、实验操作办法

1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一样平常为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱安排16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，重复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加关闭液200微升，37℃安排一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液比照。37℃安排2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 安排37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 视察效果：用酶联免疫检测仪纪录490nm读数。

五、实验注重事项

1．正式实验时，应划分以阳性比照与阴性比照控制实验条件，待检样品应作一式二份，以包管实验效果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可接纳羊血清、兔血清或BSA等关闭。
2．在ELISA中，举行各项实验条件的选择是很主要的，包括
(1)固相载体的选择：
许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管等。现在常用的是96孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可举行筛�。河玫攘靠乖�，在统一实验条件下举行反应，视察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否优异。
(2)包被抗体(或抗原)的选择：
将抗体(或抗原)吸附在固相载体外貌时，要求纯度要好,吸附时一样平常要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其卵白量也有一定影响,一样平常多接纳4℃18～24小时。卵白质包被的最适浓度需举行滴定：即用差别的卵白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)举行包被后，在其它试验条件相同时，视察阳性标本的OD值。选择OD值最大而卵白量最少的浓度。关于大都卵白质来说通常为1～10μg／ml。
(3)酶标记抗体事情浓度的选择：
首先用直接ELISA法举行起源效价的滴定。然后再牢靠其它条件或接纳“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体划分为差别的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其事情浓度。
(4)酶的底物及供氢体的选择：
对供氢体的选摘要求是价廉、清静、有显着地显色反应，而自己无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注重防护。有条件者应使用不致癌、迅速度高的供氢体，如TMB和ABTS是现在较为知足的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必需新鲜配制，尤其是H2O2临用前加入。
(5)样品：
通过查文献或预实验或许确定标本中样品含量，再对样品举行稀释，加样。

六、ELISA的特点

特点一：迅速性
该测定法的迅速度来自作为报告基团的酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大宗的催化反应，爆发可供视察的显色反应征象。因此该系统常被称为酶放概略系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其举行定量。
例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性�？乖固宓牧凳抵噬现槐⒃诳乖目乖鲆榇赜肟固宓目乖滴坏阒�。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，以是抗原抗体反应具有高度的特异性。

怎样准确的举行elisa测定操作办法
临床ELISA测定现通常为接纳手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作很是简朴，一样平常涉及到标本的网络生涯、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、效果判断和效果报告及诠释等方面，其中任一办法的不当都会影响测定效果，且尤以加样、温育和洗板等办法为甚。现分述如下。
临床标本的网络和生涯
用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时由于特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。现在临床上使用血清标本测定的标记物一样平常有熏染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标记物、激素、特种卵白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的网络，要注重网络时间甚或体位有可能会对测定效果爆发影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值泛起：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方法释放，因此，在测定此类激素时，有须要在亲近相连的时间距离内接纳数份血样本，以其中心值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将泛起显着增高。再如治疗药物的检测，应凭证药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于熏染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标记物和特种卵白等的检测的血清标本的网络则没有时间和体位方面的影响，只是在处置惩罚和生涯方面要思量以下几个方面。
（1）要注重阻止泛起严重溶血。血红卵白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红卵白浓度较高，则其就很容易在温育历程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。
（2）样本的收罗及血清疏散中要注重只管阻止细菌污染，一则细菌的生长，其所渗透的一些酶可能会对抗原抗体等卵白爆发剖析作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶自己会对用响应酶作标记的测定要领爆发非特异性滋扰。
（3）血清标本如是以无菌操作疏散，则可以在2～8℃下生涯一周，如为有菌操作，则建议冰冻生涯。样本的长时间生涯，应在-70℃以下。
（4）冰冻生涯的血清标本须注重阻止因停电等造成的重复冻融。标本的重复冻融所爆发的机械剪切力将对标本中的卵白中分子爆发破损作用，从而引起假阴性效果。别的，冻融标本的混匀亦应注重，不要举行强烈振荡，重复倒置混匀即可。
（5）标本在生涯中如泛起细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
试剂准备
在临床实验室，对试剂准备一样平常不太注重，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不敷的问题，其直接的效果是对一些弱阳性标本的检测泛起假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为要害的是，在实验最先前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下安排20分钟以上后，再举行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应办法中，能使反应微孔内的温度能较快地抵达所要求的高度，以知足测定要求。其次，现在的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应包管质量。别的，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前暂时配制。
加血清样本及反应试剂
在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入险些是唯一的要使用微量加样器加入样本的办法。使用微量加样器加样必需注重的要害点是：加样不可太快，要阻止加在孔壁上部，不可溅出和爆发气泡。加样太快，无法包管微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对相近孔爆发污染。泛起气泡则反应液界面有差别。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注重滴加的角度外，滴加的速率也很主要，滴加太快，很容易泛起重复滴加或加在两孔之间的征象，这样就会在孔内的非包被区泛起非特异吸附，从而引起非特异显色。以是，有时间一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的过失所致。
温育
温育是ELISA测定中影响测定成败最为要害的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的连系反应在固相上举行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全连系，必需在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
温育这一步是临床ELISA测定中最容易泛起问题的办法。通常现在海内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，入口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才华有较完全的连系，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在现实测定操作中一定要注重以下几点：

（1）要包管在设定的温度下有足够的反应时间。一样平常来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温较量低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还较量长，而在临床实验室中，很少有人注重这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即最先计时，这样就很容易造成现实测定中温育时间不敷，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站偕行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床磨练中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原由于何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不敷，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为包管37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室差别季节（差别室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才华抵达37℃，从而适当延伸板条在温箱中的安排时间。详细的做法是，用一小温度计安排板孔反应溶液中丈量视察即可。