细胞免疫功效检测

2017-09-04

会见量：

T细胞增殖功效测定

基础理论:本手艺用于评估T细胞对种种刺激的增殖能力。T细胞增殖能力是反应T细胞功效的一个主要指标。

刺激T细胞增殖的因素及意义

1. 特异性抗原：引起寡克隆活化增殖�？擞糜谂卸峡乖庖叩男Чㄒ呙缃又郑┖突匾浞从δ芰�，也能反应T细胞总体的功效。

2. 丝裂原：多克隆。

3. 刺激信号转导分子：多克隆。

T细胞增殖测定要领

1. 显微镜下视察细胞形态与细胞计数。

2. 放射性核素掺入试验。

细胞增殖时，DNA复制，须从作育液中增补核苷酸。用放射性核素标记作育液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），当DNA复制时， 3HTdR掺入正在破碎的细胞的DNA中。细胞增殖水平与细胞内掺入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定作育细胞中的放射性强度，就可以确定T细胞增殖的能力与强度。

丝裂原诱导的增殖反应

诱导T细胞增殖反应的丝裂原

1. PHA（植物血凝素）

2. Con A（刀豆卵白 A）

3. PMN（美洲商陆）

手艺要领

1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。

2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。

3.96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入100?l细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组划分加入一种稀释度的PHA溶液，最后一组加作育液（比照组）。

4. 37°C ，5％CO2，54h。

5. 配制浓度为50?ci/ml的3HTdR。

6. 每孔加入50?ci 3HTdR，继续作育18h。

7.用多孔自动网络仪划分网络每孔细胞于一小管中。消融细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。

8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印效果。

9. 扣除本底，盘算每一组3个复本的平均数。

影响因素

1. 细胞活力：冷冻手艺影响细胞活力，苏醒后应检查细胞活力。

2. 作育液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可接纳灭活的AB血清。

3. 细胞作育板类型：凭证细胞数目接纳差别形状底部的作育板。

4. 微生物污染：可降低细胞增殖能力。

单向混淆淋巴细胞作育反应

原理：T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个差别个体的单个核细胞在体外混适时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的水平成正比。以是同种异型混淆淋巴细胞反应的强度反应2个个体之间MHC差别的水平，并且由于相互识别与增殖，效果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混淆淋巴细胞作育试验。

将加入反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍生涯刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应效果仅反应另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需相识受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，以是适合接纳单向混淆淋巴细胞作育反应。

单向混淆淋巴细胞作育试验

要领

1. 疏散宿主与供者的PBMC，调解细胞浓度为1 x 106/ml。

2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25?g，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的要领处置惩罚刺激细胞。

3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，继续作育18h。阳性比照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性比照孔只加照射的自身细胞。3复本。

4. 网络细胞，液闪仪计数，打印效果。

5. 盘算相对反应（RR）

（实验组cpm－阴性比照组cpm）

RR＝—————————————————

阳性比照组cpm－阴性比照组cpm

注重点

1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，苏醒后应检查细胞活力。

2. 作育液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。

3. 本底应小于2000 rpm，阳性比照组应大于20000 rpm。

抗原诱导的特异性增殖反应

原理:本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是首次接触的抗原，也可以是一经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化卵白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被通例列入妄想免疫接种领域，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可削弱或消逝。

要领（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）

1. 疏散PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处置惩罚。

2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。

3. 每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，差别孔中抗原终浓度划分为0、1、5、10和20?g/ml。每一种浓度设3复本。

4. 37C°，5％CO2，6天。

5. 加3HTdR，继续作育18小时，计数。

效果诠释

1. 关于接种过破伤风疫苗者来说，本试验效果呈低反应反应患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。

2. HIV熏染者反应低下反应CD4+T细胞镌汰导致的免疫缺陷。

注重点

1. 作育液中最好用人AB血清。

2. 此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞，需加5％～10％自身APC。

B细胞爆发抗体能力的测定

基础理论:B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分解成为浆细胞，爆发抗体�？固蹇梢栽谘推渌逡褐屑斐�，检测抗体是测定B细胞功效的最主要的要领。B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者爆发学差别、接受刺激的抗原差别，对T细胞的依赖性差别。由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，以是，B细胞爆发抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于T细胞缺陷。

丝裂原诱导多克隆抗体爆发能力的测定

基础理论:人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激时，爆发多克隆激活，爆发多克隆抗体。B细胞爆发抗体的能力可以用ELISA测定作育上清中抗体的量预计，也可以用ELISPOT要领测定爆发抗体的B细胞数目预计。

手艺要领与评价

1. 疏散PBMC96孔板中每孔加入1x105细胞和PWM终浓度（1：100）。阴性比照孔内不加pWM。每一实验设2 复本。

2. 37C°5％CO2作育10天（ELISA）或7天（ELISPOT）。

3. 网络上清，用ELISA法测抗体。网络细胞，用ELISPOT法测爆发抗体的B细胞。

应用实践

1. 用于确定B细胞活化和分解的信号转导机制，以及细胞因子和其它银子对B细胞分解的影响。

2. 由于B2细胞爆发抗原需要T细胞辅助，以是又可以用于检测T细胞的辅助功效。

3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B细胞分解异常的机制。

注重点:接纳以抗体为基础的手艺（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）疏散的B细胞，需思量抗体对B细胞爆发抗体的影响（增进或抑制作用）。

ELISPOT法

基础理论:ELISPOT全称为酶联免疫黑点试验（enzyme－linked immunospot assay），可用于测定爆发IgG和IgM抗体的B细胞。其要领是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。若是B细胞爆发抗体，抗体与板上的抗原连系。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个黑点就代表一个爆发抗体的细胞。

手艺要领

1. 抗原包被：37C°2h，或4C°住宿。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。

2. 抗体天生细胞培育：加入适量抗体天生细胞，37C°，5％CO2，3～4h，或住宿。洗涤，去除为与固相连系的细胞。

3. 测定黑点爆发细胞：加二抗， 37C°，5％CO2，2～3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。

4 计数：24h后用10～30倍显微镜下计数黑点形成细胞。

评价

1. 在操作中应使用无关抗原作阴性比照；病应扫除细胞标本终抗体污染。

2. 硝酸纤维素膜迅速度高于聚苯乙烯。

3. 与ELISA联合使用，可以预计单个细胞的抗体产量。

4 当淋巴细胞受到严重污染时，也可以使用本法，以是适用于测定组织中抗体天生细胞。

应用实践:用途同ELISA法。本要领可用于任何可溶性抗原。

ELISA测定种种免疫球卵白

基础理论:B细胞受抗原刺激后，最初爆发IgM抗体，然后在Th细胞爆发的种种细胞因子的作用下，可转类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用差别的单抗，连系ELISA要领，可以测定B细胞爆发的抗体的种别。

要领

1. 包板：96孔板用浓度为10?g/ml的特异性单抗包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h，或4C°住宿。通例洗板，关闭。

2. 上样：每孔内加入1:10或1:20 稀释的细胞作育上清液100?l。阳性比照为标准品，阴性比照为作育液。每试验设2复本。室温培育2h，或4C°住宿。

3. 加酶标二抗：每孔加100?l碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室温培育2h，或4C°住宿。

4. 显色：洗板，每孔加100?l底物（p－nitrophenyl phosphate）。

5. 自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。

评价:ELISA法迅速、简朴、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选要领。碱性磷酸酶标记的二抗显色显着，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外爆发的抗体。

应用实践:ELISA可测定种种体液中的抗体，其效果反应被检个体B细胞功效。测定免疫球卵白种种亚类的水平有助于判断免疫缺陷病。

CTL杀伤功效的测定

基础理论:CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T细胞识别APC外貌MHCI类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分解形成的。当CTL遇到响应的肿瘤细胞或病毒熏染细胞时，能够通详尽胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。

1. 细胞接触机制

CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞殒命。

2. 细胞裂解机制

CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动�？帕Ｄび胂赴と诤贤ü馔率头趴帕Ｄ谌菸�。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，鲜笔备胞膜上形成孔，造成细胞裂解�？帕Ｃ赣盏及邢赴蛲�。

51Cr标记法原理

如在将靶细胞与CTL混淆之前，先用放射性核素51Cr培育，51Cr能穿详尽胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子卵白质牢靠连系，不可自由从细胞内释放。当靶细胞膜被CTL破损后，51Cr被释放进入上清。由于上清中放射性强度与细胞杀伤水平呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判断CTL杀伤能力。

手艺要领

1. 从肿瘤组织中疏散淋巴细胞和肿瘤细胞。

2. 51Cr标记肿瘤细胞。

3.96孔作育板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：靶比为50:1，25:1，12.5:1。另设最大释放比照（靶细胞加去污剂）和自觉释放比照（不加CTL）。

4. 37C°，5％CO2，4h。

5. 网络上清，?计数器测定放射活性（cpm）。

NK细胞毒性测定

基础理论:NK细胞保存于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为富厚。因细胞体积大和胞浆内含大宗颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。表型特征是CD16（Fc?RIII A）和CD56（神经细胞粘附分子）。当NK细胞识别肿瘤细胞活病毒熏染细胞时，CD16分子被交联，引起脱颗粒，并渗透IFN－?和TNF�？帕Ｖ泻写┛姿亍⒖帕Ｃ负蚿roteoglycans，引起靶细胞溶胀性殒命和凋亡。NK细胞的CD16与IgG1和IGg3连系，可介导ADCC作用。

NK细胞表达一种能识别HLA－A、－B、－C抗原的受体，向细胞发出一致性信号，阻止NK细胞的杀伤活性。当靶细胞不表达或低表达HLAI类分子时，抑制扫除，NK细胞活化，杀伤靶细胞。

K562细胞系不表达HLA分子，对NK细胞陕作用敏感，常用作NK细胞的靶细胞，用于检测NK细胞的活性。

手艺要领

1. NK细胞的疏散：用抗CD3、CD19、CD14单抗和淘洗法，去除T细胞、B细胞和Mo，获取NK细胞。

2. 加板：要领同CTL杀伤试验。差别的是，靶细胞为K562细胞。最大释放组为靶细胞中加去污剂，自觉释放比照组中不加Nk细胞。37C°，5％CO2，4h。

3. 网络上清液，?计数器测各孔cpm值。

4. 盘算％消融值：要领同CTL法。

评价

1. 本要领稳固，但51Cr污染情形。

2. 从外周血中疏散的NK细胞是静止细胞，只能杀死坚持敏感的K562细胞系，不可杀伤其它肿瘤细胞。

3. 冷冻生涯影响NK细胞活性，故宜接纳新鲜疏散的NK细胞。

4. 人血清中含有的IgG会抑制NK细胞的杀伤活性，故作育液中宜使用小牛血清。