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Western印迹剖析
表达水平的Akt和磷酸化Akt在肿瘤的老鼠
卵白印迹原理
卵白印迹实例
卵白印迹法(Western blotting)是一种将高区分率凝胶电泳和免疫化学剖析手艺相连系的杂交手艺。免疫印迹法具有剖析容量大、敏感度高、特异性强等优点 ，是检测卵白质特征、表达与漫衍的一种最常用的要领 ，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。免疫印迹常用于判断某种卵白 ，并能对卵白举行定性和半定量剖析。
卵白印迹(Western Blot)显色的要领主要有以下几种：
1. 放射自显影
2. 底物化学发光ECL
3. 底物荧光ECF
4. 底物DAB呈色
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SDS-PAGE是最常用的定性剖析卵白质的电泳方法 ，特殊是用于卵白质纯度检测和测定卵白质分子量.PAGE能有用的疏散卵白质 ，主要依据其分子量和电荷的差别 ，而SDS-PAGE(SDS变性不一连聚丙烯酰胺凝胶电泳)的疏散原理则仅凭证卵白质的分子量的差别 ，由于SDS-PAGE的样品处置惩罚液是在要跑电泳的样品中加入含有SDS ，其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键 ，破损卵白质的四级结构 ，SDS是一种阴离子外貌活性剂即去污剂 ，它可以断开分子内和分子间的氢键 ，破损卵白质分子的二级及三级结构 ，并与卵白质的疏水部分相连系 ，破损其折叠结构 ，电泳样品加入样品缓冲液后 ，要在滚水中煮5分钟变性使SDS与卵白质充分连系形成SDS-卵白质复合物 ，SDS-卵白质复合物在强还原剂巯基乙醇保存时 ，卵白质分子内的二硫键被翻开而不被氧化 ，卵白质也完全变性息争聚 ，并形成棒状结构 ，稳固的保存于均一的溶液中 ，SDS与卵白质连系后使SDS-卵白质复合物上带有大宗的负电荷 ，平均每两个氨基酸残基连系一个SDS分子 ，这时种种卵白质分子自己的电荷完全被SDS掩饰 ，远远凌驾其原来所带的电荷 ，从而使卵白质原来所带的电荷可以忽略不计 ，消除了差别分子之间原有的电荷差别 ，其电泳迁徙率主要取决于亚基分子质量的巨细 ，这样疏散出的谱带也为卵白质的亚基.样品处置惩罚液中通常加入溴酚蓝染料 ，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子 ，可以自由通过凝胶孔径 ，以是它显示着电泳的前沿位置 ，当指示剂抵达凝胶底部时 ，即可阻止电泳。另外样品处置惩罚液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度 ，使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部。最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-glycine组成�；撼逡嚎梢园�0.1%去污剂 ，通常是SDS。Tris-glycine可用于疏散很宽分子量规模（6 - 200 kDa）的卵白质 ，并且与变性或非变性条件相容。
免疫印迹法分三个阶段举行：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)——>电转移——>酶免疫定位。免疫印迹检测的详细操作历程保存很大差别。其中最常见的是直接和间接检测 ，间接检测法即一抗首先与抗原连系 ，再加入能与一抗特异连系标记过的二级抗体。标记物包括生物素、荧光探针（如荧光素和罗丹明）和酶（如HRP和AP）。这种要领的优点是单个二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而阻止了逐一标记一级抗体 ，另一方面一抗通常能与几个二抗分子连系 ，从而起了信号放大的作用。其弱点是检测历程增添了特另外温育办法。
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