卵白纯化要领大全及优弱点较量

2016-01-11

会见量：

卵白质的疏散纯化事情较为重大，从细胞中提取的卵白质或从含有卵白质的溶液中经由沉淀、梯度离心、盐析等要领获得的卵白质经常含有杂质，要去除这些杂质，同时又要坚持卵白质的生物学活性，如酶的催化活性，就需要凭证差别的卵白质制订出响应的战略，接纳差别的要领。电泳和色谱法是较量常用的要领，尤其是色谱法，对卵白质的处置惩罚较为温顺，又可大宗制备有生物学活性的纯化卵白质，因此是现在最为普遍应用的手艺要领。

卵白纯化手艺

1、卵白沉淀

卵白能溶于水是由于其外貌有亲水性氨基酸，在卵白质的等电点处若溶液的离子强度特殊高或者特殊低，卵白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀卵白最常用的盐，由于它在冷的缓冲液中消融性好，冷的缓冲液有利于坚持目的卵白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室卵白纯化的第一步，它可以起源粗提卵白质，去除非卵白因素。卵白质在硫酸铵沉淀中较稳固，可以短期在这种状态下生涯中心产品，目今卵白质纯化多接纳这种步伐举行粗疏散翻。在规�；狭蛩犸С恋硪烊员４嬉恍┪侍�，硫酸铵对不锈钢用具的侵蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不保存这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外卵白还可以用多聚物如PEG？和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对卵白有稳固效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的卵白溶液中的PEG浓度，卵白沉淀可通过离心或过滤获得，卵白可在这种状态下恒久生涯而不损坏。卵白沉淀对卵白纯化来说并不是何等好的要领，由于它只能抵达几倍的纯化效果，而我们在抵达目的前需要上千倍的纯化。其利益是可以把卵白从混杂有卵白酶和其他有害杂质的作育基及细胞裂解物中解脱出来。

2、缓冲液的替换

虽然替换缓冲液不可提高卵白纯度，但它却在卵白纯化计划中起着极其主要的作用。差别的卵白纯化要领需要差别pH及差别离子强度的缓冲液。若是你用硫酸铵将卵白沉淀出来，毫无疑问卵白是处在高盐情形中，需要想步伐脱盐，可用的要领有使用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要住宿，也难以用予大规模纯化中。新型的装备将透析膜夹在两个板中心，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的卵白溶液，并在卵白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内抵达平衡，若增添对卵白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液抵达对卵白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，卵白分子不可进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者疏散。卵白纯化的每一步都会造成目的卵白的丧失，缓冲液平衡的办法尤甚。卵白会连系在任何它能接触的外貌上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速转变很容易让卵白失活。

3、离子交流色谱

这是在所有的卵白纯化与浓缩要领中最有用要领�；诼寻子肜胱咏涣魇髦涞南嗷サ绾勺饔�，通过选择差别的缓冲液，统一种卵白既可以和阴离子交流树脂（能连系带负电荷的分子）连系，也可以和阳离子交流树脂连系。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交流树脂；羧甲基用于弱的阳离子交流树脂；季铵用于强阴离子交流树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交流树脂。卵白质由氨基酸组成，氨基酸在差别的pH情形中所带总电荷差别。大大都卵白在心理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交流柱纯化，极端的pH下卵白会变性失活.应只管阻止。由于在某个特定的pH下差别的卵白所带电荷数差别，与树脂的结协力也差别，随着缓冲液中盐浓度的增添或pH的转变，卵白按结协力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，由于前者更容易控制。在实验室中险些总是用盐浓度梯度去洗脱离子交流柱，使用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和卵白的电荷时，卵白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难准确控制，以是常用分步洗脱而缺乏一连升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交流特异性更好，有更多的参数可以调解以获得最优的纯化效果，树脂也较量自制。值得一提的是，即即是用最准确控制的条件，仅用离子交流简单的要领也得不到纯的卵白，还需要其他的纯化办法。

4、亲和层析

亲和层析基于目的卵白与固相化的配基特异连系而滞留，其他杂卵白会流过柱子。本要领保存的问题是：单抗很是腾贵，并且也需先纯化；单抗与目的卵白结协力太强.要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的卵白失活并破损单抗；混淆物中的其他卵白如卵白酶也可能破损抗体或与它们非特异连系；某些单抗也会在纯化历程中从树脂上解离下来混入产品中，也需要从终产品中去除。亲和柱通常在纯化历程的后期应用，此时标本体积已缩小，大部分的杂质已经去除。谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase，GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组卵白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本要领有以下弱点：首先，卵白上的GST必需能合适地折叠，形成与谷胱甘肽连系的空间结构才华用此要领纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，云云大的标签可能会影响表达卵白的可溶性，使形成容纳体，这会破损卵白的自然结构，难于举行结构剖析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也纷歧定能解决问题。另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和连系镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的卵白与镍柱连系，在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点，首先，由于只有6个氨基酸，分子量很小，一样平常需要酶切去除：其次，可以在变性条件下纯化卵白，在高浓度的尿素和胍中仍能坚持结协力；另外6组氨酸标签无免疫原性，重组卵白可直接用来注射动物，也不影响免疫学剖析。虽然有这么多的优点，但此标签仍有缺乏，如目的卵白易形成容纳体、难以消融、稳固性差及过失折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入卵白溶液，不但会通过氧化破损目的卵白的氨基酸侧链，并且柱子也会非特异吸附卵白质，影响纯化效果。若目的卵白可与某种碳水化合物特异连系，或者需要某种特殊的辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化制完婚和柱，连系后目的卵白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。

5、疏水作用

层析卵白是由疏水性和亲水性氨基酸组成的。疏水性氨基酸位于卵白空间结构的中心部位，远离外貌的水分子。亲水性氨基酸残基则位于卵白外貌。由于亲水性氨基酸吸引了许多的水分子，以是通常情形下整个卵白分子被水分子困绕着，疏水性氨基酸不会袒露在外。在高盐浓度的情形中卵白的疏水性区域则会袒露并与疏水性介质外貌的疏水性配基连系。差别的卵白疏水性差别，与疏水作用力巨细也差别，通过逐渐降低缓冲液中盐浓度冲洗柱子，在盐浓度很低时，卵白恢复自然状态，疏水作用力削弱被洗脱出来。

疏水性树脂的选择性是由疏水性配基的结构决议的，常用的直链配体为烷基配体（alkyl ligands）和芳基配体（arylligands），链越长连系卵白的能力也越强。理想树脂种类的选择应凭证目的卵白的化学性子而定，不可选择结协力太强的树脂，结协力太强的树脂会很难洗脱，以是最先时应选用中等结协力的苯基树脂探讨条件。为了使选择合适的介质更容易，Amersham Biosciences推出了疏水作用树脂选择试剂盒，内里包括5种差别的树脂供较量。疏水层析很适相助为离子交流纯化的下一个办法，由于疏水作用层析在高盐浓度下上样，从离子交流获得的产品不需替换缓冲液即可使用。卵白又在低盐缓冲液中洗脱，又省去了下一步纯化前的替换缓冲液的办法，既节约了时间，又镌汰了卵白的丧失。

6、排阻层析

也叫凝胶过滤或分子筛。排阻层析柱的填充颗粒是多孔的介质，柱中围绕着颗粒所能容纳的液体量叫流动相，也称无效体积。太大的卵白不可进入颗粒的孔内，只能保存于无效体积的溶液中，将会最早从柱中洗脱出来，对这部分卵白无纯化效果。由于种种卵白的分子巨细差别，扩散进入特定巨细孔径颗粒内的能力也各异。大的卵白分子会被先洗脱出来，分子越小，洗脱出来的越晚。为获得最佳的纯化效果，应将孔径巨细选在目的卵白能在无效体积和总柱床体积的中点周围洗脱。排阻层析有其他要领所不具备的优点，首先所能纯化的卵白分子量规模宽，Tosoh Biosep公司的聚合物树脂，排阻极限可达200000kD；其次，树脂微孔的形状适合疏散球形的卵白质，纯化历程中也不需要能引起卵白变性的有机溶剂。应该注重的是某些卵白不适适用凝胶过滤纯化，由于本手艺所用树脂有轻度的亲水性，电荷密度较高的卵白容易吸附在上面。排阻层析从不必于纯化历程的早期，由于这种要领要求标本高度浓缩，上样量只能在柱体积的1％～4％之间，柱子要细而长才华获得好的疏散效果，树脂自己也较量腾贵，规�；墓ひ瞪胁惶视�。

7、电泳

丙烯酰胺凝胶电泳通常用来审查卵白混淆物样品的庞洪水平和监测纯化效果。这种要领疏散效果极好，惋惜很难在不损失精度情形下放大到制备规模，由于随着胶厚度的增添，电泳时的热效应会严重滋扰卵白的泳动。在基础研究中，有时仅需要少量的纯卵白举行研究，如卵白质测序等，此时电泳纯化不失为一种轻盈快速的好要领。丙烯酰胺凝胶电泳也是卵白纯化历程中主要的剖析工具，可以检测目的卵白是在哪个梯度的离子交流柱盐洗脱液中；可用来判断近年来随着各学科的迅猛生长，对卵白纯化手艺的需求一直增添，已有的纯化要领被日益刷新，新型的纯化要领也相继涌现。羟磷灰石是磷酸钙的结晶，由于其理化性子不敷稳固，连系能力差，很难用于层析。迩来来Bio-Rad公司对其举行了刷新，提高了钙和磷的比例，使形成球形、多孔、性子稳固的陶瓷羟磷灰石颗粒，其带正电的钙离子和负电性的磷酸根离子可划分与卵白的羧基及氨基连系。通过调解缓冲液的pH值，酸性及碱性氨基酸可选择性地与此树脂连系，改变缓冲液的盐浓度可将卵白洗脱疏散。资料显示，使用这种要领能使两种等电点、分子量和疏水性相同的卵白很好疏散。

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卵白纯化要领大全及优弱点较量

1、卵白沉淀

2、缓冲液的替换

3、离子交流色谱

4、亲和层析

5、疏水作用

6、排阻层析

7、电泳