Ames试验-细菌回复突变试验

2017-07-19

会见量：

ICH推荐的标准遗传毒性试验组合

组合一

a.细菌回复突变试验
b.体外染色体畸变试验或体外微核试验或体外小鼠淋巴瘤tk试验，这三个试验可以任选其中一个。
c.体内微核试验或体内骨髓细胞染色体畸变试验；动物给药后取外周血淋巴细胞做细胞遗传学剖析也可接受，但不常用。

组合二

a.细菌回复突变试验
b.用两种差别组织做体内遗传毒性评估，通常包括体内微核试验和另一个体内试验。第二个体内试验通常选择评估动物肝脏DNA链断裂。
细菌回复突变试验是与致癌物检测最相关的体外试验。

细菌回复突变(Ames)试验

用于检测DNA损伤引起的基因突变。通过检测受试物在测试菌株某些特殊构建的突变体上引起突变的能力，即造成菌株从组氨酸/色氨酸依赖型向原养型突变，判断受试物是否为致突变剂。
试验需在加和不加s9代谢活化系统条件下同时举行。
※在作育细菌的琼脂作育基中加入痕量的组氨酸或色氨酸，允许细菌前几个小时生长，体现为配景菌苔。当加入的组氨酸/色氨酸用尽后，只有爆发了突变的细菌才可以继续生长成为肉眼可见的回复突变菌落。

差别类型的Ames试验

实验类型	作育器皿	实验时间	受试物用量
标准Ames	100mm细胞作育皿	两周	400mg
Mini-Ames	六孔细胞作育板	1周	（1）80mg测试五个菌株（2）30mg测试两个菌株
Micro-Ames	24孔细胞作育板	1周	15mg
Amesll	384孔板	1周	< 5mg

GLP试验用标准Ames试验。
在药物筛选早期常用的试验有Mini-Ames试验、Micro-Ames试验、AmesII试验等，特点是用药量少。
Mini/Micro Ames试验通常选择2个菌株（即TA98和TA100，可检测98%致突变剂），为了消除另外2%的可能性，可选择与标准Ames试验相同的5个菌株。
AmesII试验使用菌株TA98和混淆菌株TA7001至7006，将细菌与受试物预作育及一系列稀释后，在30℃作育住宿，然后接种到各有选择性试剂5-FU及pH敏感剂溴甲酚紫的384孔上，通过紫外分光光度计检测作育基变黄的水平来判断受试物致突变性。

Ames试验流程

受试物		浇到平板，孵育48-72小时
菌液
S9混淆物/PBS

测试菌株（Ames Test System）

应选择至少5种菌株

TA1535
TA1537或TA97或TA97a
TA98
TA100
WP2 uvrA或WP2 uvrA(pKM101)或TA102

每种菌株在编码组氨酸/色氨酸生物合成的使用子上有差别的突变。
外洋较多实验室选用WP2，而海内使用TA102较多。

测试菌株基因型和突变类型

菌株	氨基酸标记物			其它相关突变		质粒
菌株	突变基因	突变类型	主要基因靶点	膜突变	DNA修复	质粒
TA1535	hisG46	碱基置换	GC	rfa	UVrB	-
TA1537	hisC3076	移码	GC	rfa	UVrB	-
TA97	hisD6630	移码	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA97a	hisD6631	移码	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA98	hisD3052	移码	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA100	hisG46	碱基置换	GC	rfa	UVrB	pKM101
WP2 uvrA	trpE	碱基置换	AT	-	UVrA	-
WP2 uvrA (pKM101)	trpE	碱基置换	AT	-	UVrA	pKM101
TA102	hisG428	碱基置换	AT	rfa	+	pKM101 pAQ1

测试菌株基因型及检测敏感性

Rfa膜突变的保存增添了细胞膜对大分子化学物质的通透性
uvrB-菌株的切除修复功效有缺陷，菌株无法切除DNA加合物，是的这些菌株对大宗致突变剂的致突变性和细菌毒性敏感。
质粒pKM101上含有muc+基因，加入DNA损伤诱导的DNA修复途径，在给予细菌对抗致突变剂的细菌毒性同时，提高了易突变性。含有质粒pKM101的菌株自觉回复突变菌落数较高。

TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重复序列，位于响应的组氨酸靶位点内的突变敏感部位，他们对导致这些移码热门中碱基缺失的移码诱变剂的敏感性相似。

TA98和TA100对大部分致突变剂敏感（有数据显示这两个菌株检测阳性的致突变剂占98%，因而在前期筛选试验中可只检测这两个菌株。）
羟基蒽醌类化合物仅可被菌株TA1537检测
氧化型突变剂、DNA交联剂剂联氨仅可被含有AT位点突变的菌株TA102、WP2urA、WP2uvrA(pKM101)检测
菌株TA1535与TA100都在hisG46基因位点发热碱基置换型突变，差别点仅是TA100含有pKM101质粒，从而增添突变敏感性。可是专家组通过大宗数据显示，在已知的659种致突变剂中约5%受试物仅可被TA1535检测出，而不是TA100。

溶媒的选择

水：水溶性化合物
二甲基亚砜(DMSO)：无水溶性化合物首选
乙醇
丙酮
不常用溶媒：设立平行阴性比照

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