细胞迁徙实验效劳

2016-03-16

会见量：

肿瘤细胞迁徙是恶性肿瘤最主要的特征之一，瘤细胞由其原发部位侵入血管或淋巴管或体腔，部分细胞被血液、淋巴液带到另一部位或器官，在该处滋生生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤，这一历程即为肿瘤的侵袭和转移。

现在检测肿瘤细胞迁徙的要领主要有细胞划痕实验及Trans-Well小室迁徙实验，古板的细胞划痕实验需要一连视察以评估药物对细胞迁徙的作用，因此，其面临的最大的问题是不可包管每次视察的都是统一位点，对效果不可举行定量剖析，也不可区分划痕内的细胞是迁徙照旧增殖的而来的。而Trans-Well小室迁徙实验虽能定量检测细胞迁徙的数目，但不可直观视察细胞迁徙历程，也不可将迁徙和增殖细胞区分出来，并且其价钱腾贵，不适合抗肿瘤细胞迁徙药物的大规模筛选。

细胞迁徙实验先容

细胞迁徙与侵袭实验将Transwell小室放入作育板中，小室内称上室，作育板内称下室，上下层作育液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层作育液中的因素可以影响到上室内的细胞，应用差别孔径和经由差别处置惩罚的聚碳酸酯膜，就可以举行共作育、细胞趋化、细胞迁徙、细胞侵袭等多种方面的研究。

Transwell小室放入作育板中，小室内称上室，作育板内称下室，上室内艳服上层作育液，下室内艳服下层作育液，上下层作育液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层作育液中的因素可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层作育液中的因素对细胞生长、运动等的影响。应用差别孔径和经由差别处置惩罚的聚碳酸酯膜，就可以举行共作育、细胞趋化、细胞迁徙、细胞侵袭等多种方面的研究。

Transwell孔径的选择

※共作育实验：在选择膜孔径的时间需要思量实验的目的和实验细胞的巨细，当膜孔径小于3μm的时间，细胞不会迁徙通过，以是若是不涉及研究细胞运动能力，应选择3μm以下的，通常是0.4μm或者3μm，例如在共作育系统研究细胞B渗透或代谢产品对细胞A的影响，就可以把A种在上室里，将B种在下室。
※趋化性实验：可用5.0、8.0、12.0?m膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反应下室因素对上室细胞的趋化能力。
i.细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B渗透或代谢爆发的物质对细胞A的趋化作用。
ii.趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

肿瘤细胞迁徙实验（transwell migration）

常用8.0μm（8μm孔径的膜为文献中用来做侵袭和转移实验最常用的规格，本次订购的是Corning公司的用来做transwell migration的8μm孔径的24孔板transwell insert以及用来做transwell invasion的BD公司的8μm的24孔板铺胶transwell chamber）、12.0?m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养因素高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙能力。FBS是最常用的趋化因子，本实验也准备选用FBS作为迁徙和侵袭实验的趋化因子。

肿瘤细胞侵袭实验（transwell invasion）

常用8.0、12.0?m膜，原理与肿瘤细胞迁徙实验类似，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养因素高的下室跑，但与肿瘤细胞迁徙实验差别的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模拟体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要渗透基质金属卵白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力。

细胞迁徙实验办法

1、Transwell 小室的制备

※Corning公司的8μm孔径无胶24孔板transwell insert

i. 预平衡：在24孔板中和transwell小室中加入作育液，在37℃的作育箱里平衡一个小时或者住宿，这样能够增强细胞的粘附作用。

ii. 正式使用：24孔板中加入含5-10%FBS的作育液0.6ml，将transwell inset 放入板中（用镊子），在transwell insert中加入无血清的培液0.1ml。（操作手册提醒：实验历程中，培液的高度需要准时的去视察，当需要维持要求高度的时间可以补加新鲜培液）

※BD公司的8μm孔径铺有下层胶的24孔板transwell chamber

i.再水化：从-20℃中取出并翻开包装置于室温，往transwell小室以及24孔板中各加入37℃的培液0.5ml，然后置于37℃，5%CO₂作育箱中孵育2h使得基质胶再水化。

ii.再水化后：小心的将培液吸走，注重别触到基质胶。

2、制备细胞悬液

i. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必需的。

ii. 消化细胞，终止消化后离心弃去作育液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清作育基重悬。调解细胞密度至1－5×10⁵个/ml，详细的细胞密度需举行预实验，migration与invasion的细胞密度也有所差别（细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，若是最后用计数法统计效果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要包管在收样的时间，上室内还要有一定量的细胞保存。）

3、接种细胞

i. 取细胞悬液体积V1加入Transwell小室，差别规格Transwell小室对细胞悬液量有差别要求，参考说明书。Corning公司24孔板transwell insert中加入的体积为0.1ml，BD公司的铺胶24孔板transwell insert中加入的体积为0.5ml。

ii.24孔板下室一样平常加入体积V2含FBS的作育基（FBS浓度需举行预实验），差别的作育板加的量有差别要求，详细请参考说明书。特殊注重：下层作育液和小室间�；嵊衅荼�，一旦爆发气泡，下层作育液的趋化作用就削弱甚至消逝了，在种板的时间要特殊留心，一旦泛起气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进作育板。

iii. 通例作育12－48h，时间点的选择需思量到细胞侵袭能力、趋化因素和细胞数目等。

iv. 注重事项

l 需要思量转oligo之后与NC相比，会不会对细胞的增值以及凋亡爆发影响，若是转oligo后能抑制细胞增值以及增进细胞凋亡的话，那需要关注MDA-231侵袭能力的下降是由于细胞数目的镌汰照旧由于确实转移和侵袭能力下调了（是否需要加一个什么都不转的比照组?）

l 时间过长不可以，同样，过短也不可，由于细胞内会有一定量的MMPs贮存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从oligo的转入到进而施展作用，影响MMPs表达，到最后释放到作育基中，还需要一个历程，以是时间太短效应不显着，可是时间的延伸不可影响到细胞增值的改变。

l 细胞在小室内的形态有可能不是正常作育贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会群集成团，属正常征象（别人的履历，注重视察）

l 在作育历程中，膜下会逐渐有少量小气泡爆发，这是正常征象，可不予处置惩罚，但若是泛起了大气泡，一定要去除，不然严重影响实验效果。最好接种细胞后1－2h把作育板从作育箱里拿出来看看，确信没有大气泡爆发。

4、效果统计

※去除下层胶和未侵袭出胶的细胞（参照BD公司的操作手册）

i. 去除transwell小室中的作育液

ii. 用清洁的湿棉签，轻柔地可是均一用力擦除小室膜上外貌的基质胶以及未侵袭出胶的细胞（invasion），或者擦除未转移跨膜的细胞（migration）。

iii. 用第二根湿棉签重复一次

注重：整个历程应该只管快的完成，以免膜下外貌的细胞干掉。

※细胞牢靠与染色

i. 结晶紫染色法：先牢靠后染色，各文献中牢靠要领纷歧，大致有以下几种:100%甲醇牢靠10min、4%的多聚甲醛牢靠15min或者100%乙醇牢靠10min。牢靠完之后用0.1%的结晶紫染色染30min。该要领为文献中最常用的要领（订购结晶紫试剂）

ii. 瑞氏染色法：同样是先牢靠，可以选用100%甲醇牢靠10min，随后用瑞氏染液即A液一倍体积混淆B液2倍体积后染色响应时间。该染色要领文献中使用较少，以是染色时间有待探索，凭证小赵师兄之前的履历应该在20分钟以上。

iii. 使用BD公司的Diff-Quik staining kit：这个要领文献中也有使用，操作办法严酷凭证BD公司的使用手册，可是须购置BD公司kit，较贵。

※ 细胞计数

i.用尖锐的刀片将膜从小室中疏散下来，详细是先将刀尖插入膜与小室的边沿处形成一个小口，然后让小室逆着刀口的偏向旋转，这样膜就被疏散开来，当剩下少许毗连的时间用镊子以只管少的接触面积夹在膜上，最终将剩余的膜疏散。

ii.事先准备好一块载玻片，在上面滴一滴油，将支解下来的膜有细胞面朝上用镊子置于油上，随后再在膜上滴加一滴油，盖好盖玻片后，置于显微镜下照相计数。

注：细胞计数可以用显微照相装置拍下几个具有代表性的视野然后举行计数，也可以直接在显微镜下计数，前者较优。

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